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免疫組織化學故障排除

更新時間:2024-01-02      點擊次數:926

弱染色或無染色


 

來源

解決方案

脫蠟不充分延長切片脫蠟時間或更換新鮮二甲苯
無活性的一抗更換新一批抗體
由于儲存不當,抗體無法發揮作用將抗體分裝成較小的體積并儲存在冰箱中(-20 至 -70°C),并避免重復凍融循環。或根據制造商的說明儲存抗體。
抗體濃度太低增加一抗和/或二抗的濃度?;蛘哌\行連續稀釋測試以確定提供最佳信噪比的最佳稀釋度
抗體 孵育時間不足增加抗體 孵育時間
組織固定不充分或不正確增加后固定時間或嘗試不同的固定劑
組織過度固定減少后固定的持續時間。如果組織已經過度固定,請執行適當或推薦的抗原修復程序。
二抗和一抗不相容使用可與一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗是從兔子中產生的,則使用抗兔二抗
無活性二抗更換新一批抗體
無活性 ABC 試劑更換新一批試劑
酶底物 系統有缺陷或不相容更換新一批試劑
底物孵育時間不足增加底物孵育時間
封固劑不正確選擇正確的封固劑
試劑使用順序錯誤或步驟省略檢查注釋或使用的程序

 

過度染色

 

來源

解決方案

一抗和/或二抗濃度過高降低抗體濃度或進行滴定以確定一抗和二抗的最佳稀釋度
孵化時間太長減少孵化時間
孵化溫度太高降低孵化溫度
底物 孵育時間太長減少底物孵育時間
切片變干避免切片變干

 

高背景

 

來源

解決方案

切片清洗不充分步驟之間至少清洗 3 次
組織含有內源性酶,例如過氧化物酶或堿性磷酸酶在孵育一抗之前,使用甲醇或左旋咪唑溶液(阻斷 AP)中的 3% 過氧化氫(阻斷過氧化物酶)阻斷內源酶活性。
組織含有內源性生物素活性在孵育一抗之前,使用親和素/生物素封閉試劑封閉內源生物素活性。
一抗與組織非特異性結合或抗體濃度過高使用較高稀釋度的一抗可以減少非特異性結合
二抗與組織的非特異性結合用來自同一物種的正常血清作為二抗處理組織。
二抗與類似物種的組織發生交叉反應,即兔抗大鼠 IgG 可能與小鼠組織發生交叉反應。使用預吸附的第二抗體,即在小鼠組織上使用兔抗大鼠IgG,小鼠吸附,或在大鼠組織上使用兔抗小鼠IgG,大鼠吸附。
由于固定不充分導致組織抗原擴散增加后固定時間
用于小鼠組織的小鼠抗體一抗孵育前用 MouseOnMouse 封閉試劑處理組織

切片變干

避免切片變干



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